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細菌叢解析事業「細菌叢DNA抽出サービス」

MICROBIOME DNA EXTRACTION SERVICE

細菌叢DNA抽出サービス

信頼度の高い細菌叢解析を実現します

SERVICE OVERVIEW

サービス概要

当社では、長年の課題であった「細菌叢DNA抽出方法」の最適化に成功し、従来よりも実際の細菌叢構造を忠実に反映した細菌叢DNA解析（菌種・遺伝子組成など）の実現をサポートします。本細菌叢DNA抽出サービスは、当社CTOである服部正平らが開発したLA法（酵素的溶菌法）をベースにさらに技術的改良を施した細菌叢DNA抽出プロトコールを用います。LA法は、各種NGSによるDNAシークエンシングおよび細菌叢解析に適したDNAを提供し、既に数多くの論文や研究プロジェクトに採用されています。

細菌叢DNA抽出法技術について

マイクロバイオームを解析する技術は近年著しく進歩しました。その解析の第１ステップは、試料(糞便や唾液、皮膚など)からの細菌叢DNAの抽出です。次ぐ第2ステップは、抽出されたDNAを次世代シークエンサー(NGS)*1に供して、細菌叢がもつDNA配列データ*2の取得。そして第3ステップでは、得られたDNA配列を情報学的に解析*3して、菌種や菌種の遺伝子組成など一連の細菌叢データを得るに至ります(図1)。

 

なお、第２ステップで得られる細菌叢のDNA配列データには２種類あり、それぞれ16SリボソームRNA遺伝子(16S)データ*4とメタゲノムデータとなります(図2)。

細菌叢解析の基本プロセス

​図1.　細菌叢解析の基本プロセス

NGSを用いた16S解析とメタゲノム解析の工程

​図2.　NGSを用いた16S解析とメタゲノム解析の工程

このように、長年の試行錯誤で確立された解析工程ですが、今なお技術的な改良点がいくつも残されています。そのひとつは、第1ステップの細菌叢DNA抽出法です。これまでに様々な細菌叢DNAの抽出法が報告され、いくつものキットが販売されて来ました。しかし、それぞれのキットや抽出法で抽出された細菌叢DNAの解析から得られる細菌叢データ(菌種や菌種組成など)が、用いたDNA抽出法間で無視できないほど異なる報告がいくつもされています。

このDNA抽出法の課題の解決なくしては、解析データとデータから導かれる解釈の信頼性が担保できません。現在も新たなDNA抽出法の論文が発表され、新製品のキットが販売されていることそのものが、細菌叢DNA抽出法の課題が解決されていない証左とも言えます。求められているのは、腸内に存在する様々な菌種が完全に溶菌するDNA抽出法なのです。

 

最近、細菌叢DNA抽出法の改良にきわめてヒントになる2つの論文が報告されました。ともに日本のグループによるもので、一つはビーズを用いた機械的溶菌法を評価した論文(Microbiome, 2021)で、もう一つは酵素を用いた溶菌法を含むいくつかの既存の溶菌法・市販キットを評価した論文(DNA Res, 2023)です。ともに、モック・コミュニティー(20種類ほどの既知菌種からなる人工細菌叢)を用いて、モック・コミュニティーの菌種組成(正解)にもっとも類似した菌種組成となる抽出法について調べています。結果として、前者からは機械的溶菌法のN法、P法、Q法の3つが、後者では酵素法のLA法が優位であるという結論が導かれています。以下の図3では、2つの論文のデータを合わせて、4つの方法を含めた様々な既知法からの菌種組成とモック・コミュニティーの菌種組成間の類似性及び違いを比較しました。LA、N、P、Q法は、他のいずれの方法よりもモック・コミュニティーの菌種組成(正解)と有意に高い類似性をもつことが分かります。

様々な細菌叢DNA抽出法の比較

​図3.　様々な細菌叢DNA抽出法の比較

さらに、当社のCTO服部正平らは、実際の人糞便を用いて上記N、P、Q、LA法の4つを比較しました。その結果、LA、N、P法は互換性のある高精度なヒト腸内細菌叢のDNA抽出法であることが確認されました。（図4A）

 

一方、Q法(Nature Biotechnology, 2017)は、今回の解析では、同じ機械的溶菌法のN法とP法よりも低い類似度を示しました。また、LA法がもっとも高いDNA収量をもつことも判明しました（図4B）。これらの人糞便を用いた結果で、注目すべきは、LA法（酵素的溶菌法）とN及びP法（いずれも機械的溶菌法）という溶菌メカニズムが異なる抽出法が有意に高い類似性を示した点です。このことは、得られた菌種組成が真実の菌種組成に極めて近いことを意味します。

４つの細菌叢DNA抽出法(LA, N, P, Q)から得た菌種組成間の類似度比較

4つの抽出法を用いて同一サンプル(10名の糞便)から得られた菌種組成間の類似度をBray-Curtis距離で評価しました。LA-N, LA-P, N-P間の菌種組成の類似度は、繰り返し実験（duplicate）と同程度の高い類似度を示しました。一方、 Q法は、LA, N, P法との間で相対的に低い菌種組成の類似度を示しました。

​図4A.　4つの細菌叢DNA抽出法(LA, N, P, Q)から得た菌種組成間の類似度比較

4つの細菌叢DNA抽出法(LA, N, P, Q)からのDNA収量比較

異なった10名の人糞便(約40mg)を４つの抽出法(LA, N, P, Q)でDNAを抽出し、その重量をQubitで測定しました。このデータから、4つの方法の中でLA法がもっとも高いDNA収量をもつことが示されました。

​図4B.　4つの細菌叢DNA抽出法(LA, N, P, Q)からのDNA収量比較

LA法をベースにした細菌叢DNA抽出プロトコールは2013年の発表以来、すでに多くの研究プロジェクトに採用されています。例えば、我が国初のNGS

を用いた腸内細菌叢メタゲノム解析(DNA Res, 2016)や、日本最大規模の4,198名の腸内細菌叢を解析した研究(Gastroenterology. 2022)などが挙げられます。このほか、酵素法の利点である高分子量DNAの抽出を生かしたロングリードメタゲノム解析(Microbiome, 2019)や、高いDNA収量を生かした唾液細菌叢(Nature Commun, 2021)、皮膚細菌叢 (Sci Rep, 2023)などの菌数/細菌叢DNAが極めて少ないサンプルの解析にも活用されています。

 

当社が開始した細菌叢DNA抽出の受託事業は、Illumina社、PacBio社、Oxford Nanopore Technologies社の各NGSによるDNA配列シークエンシングに高い成功率と実績をもつLA法をベースに運用を行います。また、NGSを用いたDNAシークエンス解析の受託事業についても順次開始を予定しています。

*1. 次世代シークエンサー(NGS)：大量のDNA塩基配列を高精度かつ高速に解読するNGS(Next-generation Sequencing)装置。NGSは2010年頃に実用化され、DNA配列決定のスピードアップと大幅なコストダウンにより、今日のマイクロバイオームを含む様々な生物種のゲノム解析の推進に大きく貢献しています。

*2. DNA配列データ：DNA(デオキシリボ核酸)は生命の設計図と言われるゲノムの本体分子で、アデニン、シトシン、グアニン、チミンの４つの塩基で構成され、その並び(塩基配列)は当該の生物種が有するすべての遺伝子(＝たんぱく質などの様々な生体分子)をコードしています。​

*3. DNA配列の情報学的解析： DNA塩基配列から菌種、菌種組成、遺伝子(たんぱく質や生体分子)、多様性など、細菌叢のもつ諸性質を解析するアルゴリズムの開発などのコンピュータ・サイエンス技術。​

*4. 16SリボソームRNA遺伝子(16S)：16SリボソームRNA遺伝子(約1,500塩基対)は、細菌のたんぱく質合成を担うリボソームを構成する分子のひとつで、すべての細菌が有する生存に必須の遺伝子。16S遺伝子のDNA配列は、細菌種ごとにわずかに異なっており、この配列の違い(16S解析データ)から、細菌叢に存在する細菌種を広範囲に特定することができます。

LA法をベースとした当社の細菌叢DNA抽出プロトコールの特徴

  • 細菌種への偏りが小さい溶菌特性と高範囲な溶菌スペクトル

  • 高いDNA収量(数十mgの糞便、0.1mlの唾液からのNGS対応DNAの抽出)

  • 高分子量DNA(10kb以上の平均リード長)

  • 高品質DNA(NGSシークエンシングや定量PCRでの高い成功率)

  • 相対菌数の定量（DNA収量／糞便重量＝相対菌数*）

*当社プロトコールでは、用いた糞便量と得られるDNA収量の間にほぼ1:1の比例関係があり、個々サンプルの相対菌数の算出が可能です）

採用事例

  • 日本初のNGSを用いた腸内細菌叢メタゲノム解析（DNA Res, 2016）

  • 日本最大規模の4,198名の腸内細菌叢を解析（Gastroenterology. 2022）

  • ロングリードメタゲノム解析（Microbiome, 2019）

  • 唾液細菌叢（Nature Commun, 2021)

  • 皮膚細菌叢 (Sci Rep, 2023)     など

納品物と納品方法

  • 細菌叢DNAの（TE溶液）

  • DNA濃度/DNA収量情報と電気泳動写真

  • 冷蔵あるいは冷凍状態での納品 (要相談)

HOW TO USE THE SERVICE

サービス利用方法

ご依頼から納品までのフロー

一般的な流れについてご説明いたします。

6.納品・納期

抽出したDNAのTE溶液を冷蔵あるいは冷凍での状態で納品（DNA濃度と電気泳動写真はメール添付にて納品）いたします。

検体を受理後2週間〜1ヶ月以内の迅速な納品をいたします。

5.細菌叢DNA抽出

検体が弊社に到着次第、作業を開始させていただきます。作業中、異常がある場合はご報告や相談をさせていただきます。

4.検体の採取と保管、発送

お送りする資材に含まれる採便キット/唾液採取キットをご使用の上、検体の採取を行って下さい。

検体採取後、発送するまで冷蔵~室温で保管してください。採取後36時間以内に冷蔵での発送をお願いいたします。

​

※発送時に必ず当社担当までご連絡をお願いいたします。

※検体保管や輸送の詳細に関しましては、別途ご案内いたします。

3.検体採取に必要な資材送付

資材が必要な場合は、弊社取扱いの資材の送付を行います。※資材は別途費用が発生いたします。

検体の採取

A. 糞便採取用（糞便採取容器・採便シート・糞便採取説明書・採便シート取扱い説明書）

B. 唾液採取用（唾液採取容器・唾液採取説明書）

C. 皮膚採取用、その他検体採取用（別途ご相談）

2.検体に関するご相談・各種契約

検体採取、検体の輸送方法、DNA納品方法、納期等に関するお打ち合わせをさせていただきます。その後、関係書類による委託手続きについてご案内させていただきます。

1. フォームまたはメールでのお問合せ

本サイトの[見積もり依頼/お問合せ]のフォーム経由または、 [お問合せeメール：analysis@smart-gut.com] にてお問合せください。弊社担当者から2～3営業日以内に追ってご連絡いたします。

SAMPLE COLLECTION・STORAGE・SHIPPING・TRANSPORTAITION METHOD

検体採取・保管・発送・輸送方法

ヒトの糞便採取

採便キット内容

①採便シート（楽流カップ）、②採便容器、③説明書、④ジップ付きビニール袋

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便採取の概要

  1. 当社作成の取扱説明書にしたがって糞便の採取をお願いいたします。

  2. 洋式便器に取り付けた採便シート（楽流カップ）の上に排便をします。

  3. 採取容器（保存液入り）を用意し、便を採取容器の蓋に付いたスプーンで0.1~0.5g（小指の先程度）採取します。

  4. 採便したスプーンを、保存液が含まれる容器に戻し、そのまま蓋を閉めます。

  5. 保存液と便が混ざるように懸濁（軽く複数振ってください）します。

  6. 検体発送まで冷蔵〜室温で立てた状態で保管します。採便から36時間以内に冷蔵便での発送をお願いいたします。

 ※ 採便キットと採取法の取扱説明書を送付いたします。採便キットはDNA抽出とは別料金となります（税込1,760円 / サンプル）。

便採取方法手順

唾液採取

唾液採取キット内容

​①唾液回収容器、②説明書、③ジップ付きビニール袋

唾液採取一覧2.png

唾液採取の概要

  1. 当社作成の取扱説明書にしたがって唾液の採取をお願いいたします。

  2. 漏斗（ろうと）をチューブ（保存液入り）にのせて、漏斗上に自然の唾液（0.5~1ml）をだします（15分ほどかけて何回も少しずつ出しても構いません。また、1mlを少し超えても構いません）。

  3. 唾液がチューブに入ったことを確認し、内容物がこぼれないように蓋をしっかり閉めてください。

  4. 容器を回すように数回振って、保存液と唾液を混ぜてください。

  5. 検体発送まで冷蔵〜室温で容器を立てたまま保管します。採取から36時間以内に冷蔵便での発送をお願いいたします。

 ※ 唾液採取キットと採取法の取扱説明書を送付いたします。唾液採取キットはDNA抽出とは別料金となります（税込1,320円 / サンプル）。

唾液採取方法手順

保管・発送・輸送方法

当社が採用している 保存液入り検体採取容器は、便や唾液を回収後、1ヶ月は室温で保たれるように設計されています。しかしながら、データの信頼性や再現性を向上する為、冷蔵での保管を推奨します。また、採取後36時間以内に当社へ冷蔵発送をお願いいたします。

検体保管や輸送の詳細に関しましては、別途ご案内いたします。指定の保管・発送・輸送方法以外で発生しました検体棄損に関しましては一切の責任が持てませんのでご了承ください。

PRECAUTIONS FOR SPECIMENS

検体に関する注意事項

検体の採取、保管、送付方法

検体の採取、保管、送付については当社の採取法の取扱説明書を送付いたします。

検体性状、必要量および保管・送付条件

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※ 他の動物検体に関してはお問合せフォームからお問合せください。魚類、昆虫類はお受けできません。

※ 当社採取キットに付属しています。

※ 当社は保存溶液としてRNAlaterを使用しています。

​検体受け入れ条件

本受託事業では感染症が明らかなあるいは疑いのある検体の受託は一切行っていません。当社の検体受け入れはBSL(バイオセーフティー・レベル)1[ヒトまたは動物に重篤な疾患を起こす可能性がないもの]とさせていただいています。万が一、測定中に危険な感染性検体であることが判明した場合、感染防御感染拡大抑制の為に検体の希少性等如何に問わず滅菌処分等の対応をさせていただくことがありますので、予めご了承ください。

測定後の検体の取り扱い

測定後の残存検体は、ご要望によりご返却あるいは当社で適切に廃棄させていただきます。

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見積もり依頼 / お問合せ

注）本サービスは、アカデミア・企業向けのサービスです。一般の方・個人を対象としたサービスではありません。

注）本サービスは、1回に6検体以上のご発注を受注いたします。

注）年間に200検体以上のご発注には割引をいたします（別途のご相談）。

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